课题来源与背景：广东省自然科学基金面上项目“拟穴青蟹p53信号通路在氨氮胁迫下的调控机制研究”（项目编号2019A1515011548）于2018年5月立项，项目下达文件为粤基金字〔2019〕20号。研究目的与意义：拟穴青蟹具有生长迅速、肉鲜味美、营养价 值高等特点，是我国东南海重要的养殖蟹类之一。但随着养殖规模的不断扩大和集约化程度的不断提高，养殖环境日趋恶化，青蟹的病害问题日益严重。氨氮是水产养殖中诱发疾病爆发的重要环境因子。细胞凋亡在机体应对各种环境胁迫时发挥重要的作用。氨氮胁迫能导致青蟹血细胞凋亡率升高，并且与p53信号通路具有密切的关系，但其调控机制尚不清楚。本项目以青蟹为研究对象，采用流式细胞等方法对氨氮胁迫诱导青蟹血细胞凋亡特征以及凋亡相关因子进行检测，确定细胞凋亡的发生；采用荧光定量PCR和Western Blot等技术分析p53信号通路与细胞凋亡的相关性。同时采用RNA干扰和转录组学等技术，研究p53信号通路激活或抑制对细胞凋亡的影响，并从转录组水平解析该信号通路调控细胞凋亡的分子网络路径。本研究结果不仅对深入了解甲壳动物防御的分子机理具有重要的理论意义，而且对青蟹健康养殖和疾病防控具有重要的实际意义。主要论点与论据：本研究构建了氨氮胁迫对拟穴青蟹转录组文库，共鉴定出722个差异基因，其中526个上调，196个下调。通过GO富集分析发现，差异表达基因主要被集中在代谢通路、细胞过程、生物调控等通路中，大量Toll、p53、Jak-Stat和MAPK等通路上相关免疫基因被鉴定。从拟穴青蟹中克隆了一个新型p53基因，该基因开放阅读框长1,383 bp，编码460氨基酸。p53在所有组织均能表达，在肝胰腺和血细胞中表达量最高。干扰p53基因表达后，抑制Mn-SOD，Gpx3和caspase3基因表达量。干扰p53基因表达后，在副容血弧菌感染后，死亡率和DNA损伤程度均高于对照组，说明p53在免疫应答和细胞凋亡中发挥关键作用。从拟穴青蟹中克隆了一个新caspase3基因，该基因开放阅读框长1,035bp，编码344氨基酸。caspase3在所有组织均能表达，在血细胞中表达量最高。亚细胞定位分析发现，caspase3主要定位在细胞质和细胞核中。caspase3过表达后，能够诱导细胞凋亡。干扰caspase3后，在在副容血弧菌感染后，死亡率和细胞凋亡均高于对照组，说明caspase3在免疫应答和细胞凋亡中发挥关键作用。按照工作计划，顺利按时完成了预定的研究工作，发表学术论文5篇。