（1）课题来源：

（a）国家支持：

课题来源单位：广东省科学技术厅

课题立项名称：糖尿病诊断试剂1,5-AG关键酶合成生物学改造及其产业化

业务类别：国际科技合作领域

课题立项编号：2018A050506083

时间：2018-12-01 至 2020-11-30

（b）自有资金支持。

（2）课题背景：

   糖尿病已经成为威胁中国和印度两国人民的健康和社会经济发展的首要公共卫生问题。2012年我国城市中每10万人有15.21人死于糖尿病。2013年中国成年人糖尿病的患病率约为10.9%。印度糖尿病患者位居全球第二。突破1,5-AG诊断试剂原材料的关键技术，研制低成本高质量并具有自主知识产权的1,5-AG诊断试剂，替代进口扩大临床应用范围，对一代一路国家防治糖尿病具有重要的现实意义和明确的市场前景。

全球糖尿病患者最多的十个国家，中国第一、印度第二。世卫组织呼吁，要加强糖尿病的防疗应早诊断早干预。因而，中国和印度成为最大糖尿病诊断试剂的市场。掌握糖尿病诊断试剂的核心原料技术成为占领该市场的核心。十多年以来，国内外临床数据一致充分证明 1，5AG 在糖尿病筛查、诊断、用药评估等方面均具有重要的临床价值。中华医学会糖尿病学分会已经将 1，5AG 检测项目列入了血糖监测方案。自 2012 年我国少数企业从日本进口原材料到中国组装以来，虽然国内已经申报了近 30 个 1,5AG 诊断试剂批文，但由于进口原料一直昂贵，没有真正实现国产化和工业化，无法在临床上大规模使用。

突破 1,5-AG 诊断试剂原材料的关键技术，研制低成本高质量并具有自主知识产权的1,5- AG 诊断试剂，替代进口扩大临床应用范围，对我国和一带一路国家防治糖尿病具有重要的现实意义和明确的市场前景。

 

2. 技术原理及性能指标：

    通过筛选确定耐热性菌来源 PROD 候选酶模板，基因合成方法合成耐热性菌来源的PROD 酶序列，利用原核基因表达系统表达 PROD 酶重组蛋白。分别选用 NusA-His，CKS，His，GST-His，His 融合蛋白载体进行融合表达 PROD，分析其是否有可溶性蛋白表达；通过镍离子亲和纯化及分子筛层析纯化获得高纯度的 PROD 蛋白。 对 PROD 酶重组蛋白进行酶活测定，结果显示，PROD 对 1,5-AG 0-300umol/L 之间有良好的线性反应。通过三维同源建模方法分析 PROD 蛋白结构，进行深层次分析，特别是蛋白质二级结构和三级结构可能性来判定 PROD 酶蛋白序列的可靠性。进一步分析影响酶活、底物特异性与稳定性的可能性关键氨基酸位点；利 SWISS-MODEL 同源建模方法，对 PROD 酶关键的结构域深度分析，针对影响酶活、底物特异性与稳定性的可能性关键氨基酸位点。PROD 测试剂完成工艺放大，产品送广东省检验，申请 CFDA 批文，通过临床、注册体系考核，注册受理，已于 2020 年获得CFDA 批文。

 

3. 技术的创造性与先进性：

   本研究开展 PROD 酶催化底物特异性和稳定性分子机制、克隆酵母表观遗传 UCOE 序列和 Cas9 构建重组克鲁维酵母提高表达，寻找到稳定特异、高活性高和高表达的重组PROD 酶，发挥大学基础研究的优势，直接帮助广东本地企业完成 1,5-AG 的原料规模化生产，打破了进口原料垄断的瓶颈，且成本更低，更易推广应用。 

突破 1,5AG 诊断试剂原材料的关键技术，研制低成本高质量并具有自主知识产权的 1,5AG 诊断试剂，替代进口扩大临床应用范围，对一带一路国家防治糖尿病具有重要的现实意义和明确的市场前景。

 

4.技术的成熟程度，适用范围和安全性：

    本产品适用于我国及印度不同区域，1,5-脱水-D-山梨醇与血糖、糖化血红蛋白检查指标优势互补，三者联合使用，更完整反映血糖控制情况。开展 1,5-脱水-D-山梨醇检测项目可以发现糖尿病早期患者，减轻患者治疗压力和经济压力，监测血糖波动指导治疗方案，预防并发症的发生，保障广大糖尿病患者的健康生活。产品已于 2020 年获得CFDA 批文并实现产业化应用。结果准确可靠，操作方便，适用于糖尿病早期筛查。因此，本产品相关技术成熟、安全。

 

5.应用情况及存在的问题： 

   本研究一方面可以扩大我国国产化糖尿病试剂的市场，另一方面可以提高我国生物医学技术在世界水平的竞争力，对我国和一带一路国家防治糖尿病具有重要的现实意义和明确的市场前景。

本研究前期研究基础充分，因此本研究开展中试放大和产业化进展就很顺利，项目遇需要克服的技术困难比较少。我们的经验和建议就是生物医药产业化项目周期比较长，产业化项目的验收可以延长。

 

6.历年获奖情况：尚未申请，待将来大规模使用后申报有关奖项。

部分资质入选： 

1. 成功开发了1,5-AG体外诊断试剂，取得了SFDA二类医疗器械批文1项，注册证编号： 粤械注准 20202400301 ；已经进入临床使用（中标华中科技大学协和深圳医院）。

2. 中国国家发明专利申请情况：

A. 一种快速制备糖化白蛋白标准品的方法（已授权，专利号：ZL2018 ZL201810855009.9 ）

B. 一种1,5脱水山梨醇检测试剂盒及检测方法（实审中，申请号： 202010114208.1）

C. 一种用于1,5脱水-D-山梨醇检测显色试剂（申请号：201810049362.8）。

3.论著发表：

[1] Cai Z L, Chen J J, Zhang Z, et al. Identification of immunodominant IgE binding epitopes of Der p 24, a major allergen of Dermatophagoides pteronyssinus[J]. Clinical and Translational Allergy, 2019, 9(1): 1-12. 

[2] Cai Z L, Zhang Z, Luo W L, et al. Identification of immunodominant IgE epitopes of the major house dust mite allergen Der f 24[J]. International journal of molecular medicine, 2019, 44(5): 1888-1898. 

[3] Chen J J, He Y S, Zhong X J, et al. Ribonuclease T2 from Aspergillus fumigatus promotes T helper type 2 responses through M2 polarization of macrophages[J]. International Journal of Molecular Medicine, 2020, 46(2): 718- 728. 

[4] Zhang L N, Ji K, Sun Y T, et al. Aurora kinase inhibitor tozasertib suppresses mast cell activation in vitro and in vivo[J]. British journal of pharmacology, 2020, 177(12): 2848-2859.

 

4.人才培养：培养硕士研究生4名，工程技术人员5名。