以猪、牛、鸡、鸭肉和大豆蛋白原料为研究对象，采用纳升级液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱鉴别肉蛋白筛选特征肽，基于数据依赖型采集模式和多元统计分析对不同的肉蛋白进行相对定量探讨非标记蛋白组学法在肉丸掺假鉴定中的应用，基于高分辨质谱的定量方法测定牛肉丸样品中特征肽的含量，基于重组酶介导等温核酸扩增技术-侧流免疫技术构建快速筛查验证牛肉丸中肉的种属来源。采用纳升级液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪从猪肉、牛肉、鸡肉、鸭肉、大豆分离蛋白等原料中共分别鉴定出归属于2715，889，659，1143、872种蛋白质的80554、33350、40969、32923、34721条肽段，通过序列搜索（BLAST）和UniProt数据库比对分析，分别鉴别出猪、牛、鸡、鸭肉和大豆蛋白源特征肽段12、15、19、16、15条，特征肽信号强度高，重现性好，可用于蛋白种属鉴别和相对定量。不同价位的牛肉丸中鉴别到的蛋白差异显著，采用非标记定量蛋白组学和二维正交偏最小二乘判别分析可以很好地区分纯牛肉和掺假的牛肉丸，有69.2%的牛肉丸样品中含有猪肉或鸡肉。采用四极杆轨道阱高分辨质谱的平行反应监测模式和靶标单一离子监测/数据依赖扫描模式可定量测定牛肉丸中特征肽的含量，12批次牛肉丸样品检测中共检出含有猪肉源或鸡肉源特征肽的比例为58.3%，其中有明确标识的为42.8%，检出含有大豆蛋白的样品2批。同时，采用TOF-MRM采集模式和目标增益采集数据可增加目标离子的灵敏度，7类牛肉丸样品中共检测出5条特征肽，其种属来源分别为牛肉2条、猪肉1条、鸡肉2条，这表明测定的牛肉丸样品中不同程度地混有鸡肉或猪肉。基于视觉的方法应用重组酶聚合酶扩增和横向流动试纸对牛、绵羊、猪、鸭和鸡肉进行鉴定，反应在20min完成、结果肉眼测定、检测限低，还可以对水煮、微波、压熟和油炸的物种进行鉴别，构建了一个快速、移动的检测系统可快速筛查牛肉丸制品中肉的种属来源。