项目为广东省科技计划国际科技合作专题，旨在加强与国外科技领域合作，提升我国科技创新能力和水平。项目以禁用但残留问题仍较为突出的对硫磷、杀螟硫磷等农药为代表性研究对象，以前期构建的纳米抗体库为基础，筛选特异性纳米抗体基因，通过大肠杆菌重组表达制备高质量纳米抗体，并以此建立免疫快速分析方法，进而开发快速检测试纸条，用于实际样品的快速检测。针对稳定性差的部分纳米抗体则采取基因突变手段进行建库淘筛后再应用于试纸条的开发。

② 技术原理及性能指标

    技术原理：项目针对杀螟硫磷等，通过设计合成半抗原、与载体蛋白偶联制备人工抗原，将人工抗原免疫骆驼，经过4-6轮免疫后取骆驼的外周淋巴细胞提取总RNA，并转录成cDNA，然后设计引物进行重链抗体序列扩增，获得重链抗体的基因片段后与载体蛋白偶联，构建噬菌体纳米抗体库，通过研究不同筛选手段对特异性纳米抗体进行淘筛与鉴定，获得阳性克隆，再进一步通过噬菌体表面展示技术制备和表达纳米抗体，进行亲和纯化。针对稳定性差的部分纳米抗体则采取基因突变手段进行建库淘筛。最后基于野生型或进化型纳米抗体建立快速检测方法，并开发快速检测产品，进行推广应用。

    性能指标：系统研究了固相包被法、磁珠法、生物素标记液相筛选等淘筛方法，成功筛选获得了包括等3-苯氧基苯甲酸、喹硫磷、克百威、杀螟硫磷、1-萘酚、腐霉利等6个对象的特异性纳米抗体46个（株）。优化了基于噬菌体表面展示的纳米抗体高效表达技术，实现了纳米抗体的基因工程菌大量制备，表达量最高达10mg/L，纯度>98%；建立了农药小分子化合物纳米抗体-农药小分子的复合物识别模型，实现定向进化，性能较野生型纳米抗体显著提升，其中其中24A-Y、24A-W、18L-W 相较于野生型稳定性提高，当反应温度到65 ℃时保留75%-100%的抗原结合活性；在50%乙腈条件下，24A-W和24A-Y仍然保持100%的结合活性，野生型纳米抗体只有50%，对丙酮和甲醇的耐受性与野生型相当；对碱性溶液的耐受性高于野生型，保留50%-100%的结合活性；建立了基于纳米抗体的对硫磷、杀螟硫磷、萘酚、3-苯氧基苯甲酸等的ELISA方法和胶体金免疫层析方法，检测灵敏度分别达1.0ppb和20.0ppb。

③ 技术的创造性与先进性

    项目构建了小分子农药的纳米抗体筛选平台，探究了纳米抗体晶体结构与稳定性的联系，并采取了多种突变方式筛选稳定性提升的进化型纳米抗体，突破原纳米抗体有机耐受性能差的瓶颈，实现喹硫磷、杀螟硫磷等化合物纳米的定向进化，稳定性和灵敏度等性能显著提升。相对传统的单克隆和多克隆抗体，纳米抗体具有稳定性好、亲和力高以及制备成本低、批次稳定等特点，有望替代传统抗体在食品安全快速检测中进行应用。

④ 技术的成熟程度，适用范围和安全性

    目前纳米抗体制备的技术已经较为成熟，纳米抗体适用于食品安全检测、环境监测以及医疗诊断等领域。纳米抗体的制备采用基因工程菌表达，属于常规技术，不存在安全性问题。

⑤ 应用情况及存在的问题

    项目目前开发了基于纳米抗体的对硫磷/杀螟硫磷胶体金层析检测卡各1个，通过第三方验证，并进行了产业化与推广应用，累计应用量超过8000样份。目前处于初步应用，由于与纳米抗体相配套的试剂如二抗等开发尚不完备，而且市场上对纳米抗体的认知度还不够，因此应用推广尚存在一定的难度。

⑥ 历年